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Dentro de la célula, la doble hélice de DNA está rodeada y enrollada por varias proteínas. Cuando un investigador intenta aislar una molécula de DNA sin proteínas, se encuentra con que tales moléculas de DNA son muy largas y muy delgadas (Típicamente, en la célula humana las moléculas de DNA tienen proporciones axiales de 1:10000) y debido a esta desproporción se rompen con mucha facilidad. El resultado neto es que si se extrae y purifica DNA por ejemplo, de 1000 células diploides idénticas, habra 2000 copias de cualquier gene pero cada una de ellas estará en un fragmento de longitud diferente, con extremos diferentes.
Este problema dificultó en gran medida el estudio de los genes por métodos químicos y bioquímicos, pues no era posible obtener cantidades preparativas de un gene en forma pura. Durante tres cuartos de siglo la genética progresó utilizando los métodos llamados hoy día métodos genéticos, a saber mutación, segregación y recombinación. A principios de la década de 1970 se descubrieron las enzimas de restricción del tipo II, que permitían cortar el DNA y producir fragmentos más fáciles de aislar y caracterizar; y una técnica conocida como Reacción en Cadena de la DNA Polimerasa o PCR fue inventada en 1983. En la actualidad los genes (de cualquier organismo) se clonan por ingenieria genética o por PCR y se estudian con facilidad extraordinaria, de la cual, no ha gozado ninguna otra macromolécula compleja. La ventaja del DNA como material de estudio no es solo técnica, pues también hay ventajas conceptuales; cuando conocemos la secuencia de un gene se conoce la secuencia del DNA e instantáneamente se puede inferir la secuencia del RNA complementario y la secuencia de la proteína, las 3 moléculas relacionadas colinealmente.

CLONACIÓN
La clonación de fragmento de DNA se efectua en tres pasos:

1. CORTE: Las moléculas de DNA se pueden cortar en sitios específicos con endonucleasas de restricción del tipo II. Las endonucleasas de restricción del tipo II reconocen en el DNA de dos bandas secuencias cortas, cortan las dos bandas de la molécula y la mayor parte produce fragmentos de DNA con extremos complementarios de una banda, llamados extremos pegajosos.
   La utilidad de las enzimas tipo II para los análisis de DNA se deriva de las siguientes cuatro propiedades importantes:

   1. Reconocen secuencias cortas (de 4 a 7 pares bases), de tal manera que la probabilidad de tener una molécula de DNA por lo menos con un sitio de reconocimiento para cualquier enzima es muy grande.
   2. Cortan siempre los mismos sitios, lo cual hace que las observaciones sean reproducibles y reales.
   3. Cortan virtualmente todos los sitios disponibles en el DNA aunque cortan unos sitios más rápidamente que otros.
   4. La mayoría de las enzimas producen DNA de dos bandas con extremos pegajosos, que son las moléculas más fáciles de ligar In Vitro.
      
2. UNION: Dos o más fragementos unidos pro enzimas forman moléculas recombinantes. Los fragmentos de DNA pueden ser de cualquiera de las siguientes fuentes:
• DNA naturales de diversos organismos, generados por cualquier sistema de corte.
• Moléculas de DNA sintetizadas enzimáticamente, usando RNA como molde para la transcriptasa inversa.
• DNA artificiales producidos por síntesis química y/o enzimática.
3. CLONACION: Para que la unión de dos moléculas de DNA sea de utilidad práctica, una de las dos debe ser autorreplicante, es decir, debe tener suficiente información para replicarse en alguna célula viva disponible. Plásmidos y Virus llenan esta condición pues pueden ser introducidos a células apropiadas donde se replican normalmente, junto con el DNA inserto. Se debe definir ahora algunos términos útiles:
   Vector o Vehículo: Es la molécula autorreplicante.
   Inserto: Es el fragemento de DNA "exógeno" que se liga al vector.
   Anfitrión: Es la célula empleada en la propagación del vector con su inserto, es decir, el DNA recombinante.
   Clonación molecular: Es la propagación en la célula anfitriona de las secuencias de DNA inserto. Las células con un DNA recombinante se pueden clonar.

CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LEVADURAS
Un ejemplo de vector para la construcción de cromosomas artificiales en el pYAC2 (Figura 1).

Figura 1. Cromosoma artificial de Levadura

Este plásmido tiene el Ori de E. Coli, el gen de la resistencia a Ampicilina y otras regiones cortas de pBR322. De las levaduras derivó el locus ARS1 ("Secuencia de replicación autónoma" en levaduras), el locus CEN4 (Centrómero del cromosoma 4), el locus sup4 (un alelo supresor del gen try-tRNA, que es interrumpido por corte con la enzima SmaI, el sitio de clonación); TRP1 y URA3 (Dos marcadores a lado y lado del centrómero) permiten la selección de moléculas que han adquirido ambos brazos cromosómicos del vector . Dos secuencias TEL promueven la formación de telómeros y fueron derivadas de los extremos de moléculas de rDNA del macronúcleo de Tetrahymena (un protozoario).

El cromosoma artificial pYAC2 permite la clonación, en levaduras, de fragmentos de DNA de varios cientos de kilobases que se replican y segregan en forma de cromosomas lineales artificiales. La eficiencia de la clonación es lo suficientemente alta, como para permitir la construcción de bibliotecas genómicas de organismos superiores.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR

La reacción en cadena de la polimerasa se usa para amplificar por síntesis un segmento limitado de DNA del cual se conoce la secuencia en los extremos .

Figura 2.

Reacción en cadena de la polimerasa. Una molécula de dos bandas (Flechas largas y delgadas) se denaturaliza por calor y los primers (cajas obscuras que aunque se representan como si fuesen iguales son de diferente secuencia) reaccionan con secuencias específicas a lado y lado del segemento que se va a amplificar. Los primers son extendidos por síntesis de DNA (Flechas discontinuas) con una DNA polimerasa. Estas tres reacciones representan un ciclo y este ciclo puede repetirse hasta 40 veces. En cad ciclo el número de fragmentos largos aumenta aritméticamente y el número de productos cortos (el fragmento que se desea amplificar) aumenta geométricamente. Con eficiencia perfecta en 20 ciclos el fragmento que se va amplificar ha sido amplificado (y purificado) 1000000 de veces.

Como se ilustra en la figura 2, para la amplificación por PCR de secuencias de DNA, se utilizan dos oligonucleótidos como cebadores (Primers) para dirigir una reacción en serie catalizada por una enzima DNA polimerasa. Estos oligonucleótidos tienen secuencias diferentes entre sí que son complementarias a los extremos de cada una de las cadenas de DNA que se van a amplificar. En el proceso el DNA que se va a amplificar es primero denaturalizado por alta temperatura (90 a 100ºC) en presencia de concentraciones en exceso, tanto de los dos oligonucleótidos cebadores como de los cuatro dNTPs. La mezcla de estos componentes se enfría para permitir que los oligonucleótidos cebadores se pareen por complementaridad con las respectivas secuencias blanco y por último se ejecuta la síntesis y extensión por efecto de la DNA polimerasa.
Cada ciclo de denaturización y apareamiento complementario de los oligonucleótidos cebadores y síntesis de DNA se repite muchas veces; y como los productos de un ciclo de amplificación sirven como moldes para los ciclos sucesivos, entonces en cada vuelta de amplificación se duplica la cantidad de DNA.